作者：Mingfang Yang, Yunlong Zheng, Yuqing Cai, Jinbiao Guo, Along Zuo, Jiangyue Yu, Sainan Zhang, Zhenjie Zhang, and Yao Chen*

单位：Key Laboratory of Biopharmaceutical Preparation and Delivery, State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100190, China等

手性分离在工业应用和生产中都起着关键作用。然而，传统的硅胶基质手性固定相（CSP）存在耐碱性差的缺点。为了解决该问题，作者将嗜碱性的碱性蛋白酶（basophilic alcalase）通过共价-有机框架（COF）进行固载，形成新的高稳定性的CSP，并利用高效液相色谱（HPLC）实现在碱性条件下对多种酸性手性化合物的分离。        

   手性分析和分离技术的进步与手性固定相（CSP）材料的发展密切相关。理想的CSP应具备以下特征：（1）手性识别能力强、适用范围广、选择性高；（2）CSP的组件易于设计、调整和优化；（3）高稳定性和长期耐用性。然而，目前普遍使用的CSP，特别是硅胶基质的CSP，仍然存在许多问题，例如组装困难、适应范围窄（例如硅胶pH耐受范围约为2-7）、稳定性差等，因此，需要对CSP进行进一步地设计开发。在构建CSP的各种方法中，基于蛋白质的复合材料显示出巨大的潜力，这是因为蛋白质分子具有复杂和特异的三级结构以及高手性密度的分子表面，能够与手性底物产生更多更强的相互作用。但是，当前基于蛋白质的CSP的也存在两个问题，一是目前实现商业化的蛋白质基CSP均在碱性条件下不稳定；二是大部分基于蛋白质的CSP，其基质缺乏多孔性，蛋白质通常只能通过涂敷或者键合负载在基质表面，在使用中容易出现蛋白质泄漏，导致CSP的不稳定性。在该研究中，作者通过将耐碱性的碱性蛋白酶通过一步反应，固载于COF中，形成新型的CSP，以实现在碱性条件下分离酸性化合物，其思路如图1所示。

图1 碱性蛋白酶构筑的CSP及其对酸性对映体的分离

1、嗜碱性碱性蛋白酶的手性识别能力研究

   碱性蛋白酶的尺寸为3.8 nm×5.0 nm×5.0 nm，是一种低成本酶，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，在食品加工、手性药物生产和生物技术等领域均有重要应用。碱性蛋白酶作为一种嗜碱性蛋白，与常用的识别蛋白存在显著差异。为了初步评估碱性蛋白酶对酸性手性底物的分离能力，作者以2-苯基丙酸（DL-Phe）为模型分子，采用分子动力学模拟的方法计算了碱性蛋白酶对该分子的结合作用。结果表明，与其它三种商用的蛋白质HAS、AGP和 CBH相比，碱性蛋白酶对2-苯基丙酸的两种异构体均具有更强的亲合性，且对两种异构体的结合力也存在显著差异。进一步用分子对接评估碱性蛋白酶与一系列手性底物的选择性吸附和分离能力，结果表明碱性蛋白酶对系列化合物的D和L构型的作用力不同，呈现出手性分离的潜能，计算结果如图2所示。

图2 碱性蛋白酶与对映体结合的分子模拟。碱性蛋白酶与DL-Phe的（a–b）分子对接和（c）二维相互作用图，碱性蛋白酶和RS-氟比洛芬的（d–e）分子对接以及（f）二维相互关系图。

2、碱性蛋白酶基CSP的制备与表征

   作者选用具有高稳定性的腙键连接的COF材料NKCOF-98作为酶固定化平台。由于COF的孔径通常小于3 nm，无法通过孔洞吸附的方法直接固定化碱性蛋白酶，因此，作者采用一锅原位合成的方法将碱性蛋白酶引入COF框架中。根据碱性蛋白酶保持最佳活性的条件（最佳pH范围为9.0-11.0、温度55–60°C），将COF单体[2,5-二（2-甲氧基乙氧基）对苯二甲酰肼和1,3,5-三甲酰基苯]和碱性蛋白酶在Na₂HPO₄-Na₃PO₄缓冲液（pH=10.5）中60 °C下加热2小时后即可形成目标复合材料，即alcalase@NKCOF-98，如图3a所示。通过PXRD（图3b）、氮气吸附-脱附等温线（图3c）和共焦激光扫描显微镜（图3d）等表征确定碱性蛋白酶成功固载在COF中。此外，活性测试表明负载在COF中的碱性蛋白酶保持有游离碱性蛋白酶53%的活性，并且，与游离碱性蛋白酶相比，alcalase@NKCOF-98中的碱性蛋白酶可以在各种苛刻条件下保持其大部分的初始活性（例如，100 摄氏度下，活性保留99%；DMF中保留95%；阴离子表面活性剂SDS中保留95%；高浓度尿素中保留99%；pH=4.0的柠檬酸溶液中保留90%；而在相同的处理条件下，游离碱性蛋白酶仅保留<30%）。

图3 alcalase@NKCOF-98的合成与表征：（a）alcalase@NKCOF-98的合成过程。（b）alcalase@NKCOF-98、NKCOF-98的实验PXRD和NKCOF-98的模拟PXRD。（c）alcalase@NKCOF-98和NKCOF-98的N₂吸附等温线。（d）FITC-alcalase@NKCOF-98的CLSM图像。

   此外，以酸性底物L-Phe和D-Phe为例，通过动力学吸附实验表明，随着碱性蛋白酶负载量的增加，alcalase@NKCOF-98对L-Phe和D-Phe吸附量的差异性也增大，在负载量为0.40 g/g时，对两种异构体的吸附量差异达到约0.08 g/g。然而，alcalase@NKCOF-98对碱性底物RS-氯苯那敏、RS-西替利嗪、RS-羟丙哌嗪和中性底物RS-苯偶姻、RS-1-苯乙醇几乎没有吸附，即不能分离这些药物。分子对接和控制实验表明，alcalase@NKCOF-98对异构体的分离性能可能来自于蛋白质的手性构象，而与蛋白质的活性中心无关。

3、碱性蛋白酶基CSP的HPLC分离性能

   将alcalase@NKCOF-98作为CSP填充在色谱柱中，利用HPLC研究了其对手性异构体的分离性能。使用六种不同的外消旋体：DL-Phe、DL-Leu、RS-氟比洛芬、RS-舒林酸、RS-扎托洛芬和RS-替诺福韦进行了研究。为了利用碱性蛋白酶的嗜碱性来评估CSP的分离效率，特意选择pH值为10.0的缓冲液作为流动相，并通过控制有机溶剂甲醇的比例调节CSP对分离底物的选择性。结果表明，alcalase@NKCOF-98对选择的所有外消旋体都实现了基线分离，部分结果如图4所示。其中，RS-舒林酸、RS-扎托洛芬和RS-替诺福韦首次使用基于蛋白质的手性柱实现了手性分离，其分离效果优于商业多糖或环糊精基手性柱。

图4 alcalase@COF的手性分离性能：(a) alcalase@NKCOF-98 制备的CSP用于手性分离的示意图。(b) alcalase@COF分离异构体的色谱图。

   论文还研究了COF结构对alcalase@COF分离性能的影响，结果表明，通过单体侧链基团的改性可以精细调节COF的亲水性和孔径，而亲水性和孔径的增大可以提高分离效率。稳定性测试则表明alcalase@NKCOF-98在6周的评估期内2400多次运行之后仍保持高分离效率，超过了一般商业手性分离柱的性能（通常<1000次运行）。

首次将嗜碱性的碱性蛋白酶用于CSP，实现在碱性条件下进行对映体分离。首先，通过理论模拟和分子对接预测碱性蛋白酶对手性底物表现出不同的吸附能力，表明了其手性分离的潜力。随后，采用碱催化原位固定化策略将碱性蛋白酶负载到腙连接的COF中。所得到的alcalase@COF对酸性底物具有选择性亲和力，可以用作HPLC的CSP，在碱性条件下实现了一系列酸性手性底物的基线分离。此外，证明了具有亲水性和较大孔径的COF基质可以提高分离效率，并且，该CSP表现出卓越的分离稳定性（>2400次运行）。该研究为研发高性能CSP提供了一种新方法。

论文信息：

Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202420269. doi.org/10.1002/anie.202420269

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